高攀龙祖父静成，被举为孝廉，曾任浙江黄岩县令。生父继成，生有五个子女，高攀龙是老二。静成的弟弟静逸无子，于是将高攀龙过继为嗣子。

高攀龙从小喜读书，非常懂礼节。六岁开始读书，十二岁学写八股文，二十一岁中举。万历十四年（1586），无锡知县李元冲聘请江右学派的罗懋忠和顾宪成到黉宫讲学，高攀龙受其影响，开始潜心研究程朱学说，确定了治学方向。万历十七年（1589）中进士，不久，嗣父去世，他回家为嗣父守制三年。

万历二十年（1592），高攀龙服满，被任命为行人司行人，开始了曲折坎坷的政治生涯。行人司行人执掌传圣旨、行册封等礼仪性的事务，比较清闲。高攀龙大量阅读了行人司中丰富的藏书，尤其是仔细研读了二程、朱子的著作和明朝山西大儒薛文清的《读书录》，并亲手摘抄。他尤其赞赏薛文清“一字不可轻与人，一言不可轻许人，一笑不可轻假人”的处世态度，以后行事必自求无愧于这一原则。他还编写了《日省编》，将先朝大儒的语录附在《大学》章句之下，作为初学者的指南。高攀龙又将先朝大儒有关儒、释差异的言论汇集成《崇正编》，以抵制王阳明心学所提倡的儒、释、道三教合一的主张。也就在这一时期，高攀龙感觉自己读书虽多，但心得较少，于是采取半日读书、半日静坐的方法，涵养德性。此后几十年，从未间断。可以说，高攀龙之所以能不以自身的进退为怀，坦然面对政治生活中的腥风血雨，达到崇高的道德境界，与他长期的修身养性是分不开的。

此时的明王朝已经进入了衰败期，神宗长期不理政务，朝中党派纷争，宦官横行，致使朝政混乱，国力日衰。高攀龙从政不久，就上了一道《要务疏》，提出要改变明王朝岌岌可危的形势，首先必须正本，即端正“人君之心”；其次要“除刑戮”、“举朝讲”、“用谏臣”、“发内帑”，以革新政治。但这道奏疏被皇帝留中不发。后来，首辅王锡爵等权贵在六年一度考察京官的过程中，大肆排斥异己，被贬削者总计达六十余人，朝廷上正直的官员为之一空。高攀龙的同年御史袁可立上疏针砭朝政，王锡爵怂恿明神宗将之削职为民。高攀龙为此愤激不已，上《君相同心惜才远佞以臻至治疏》，对神宗无故罢免大臣深表不满，并对王锡爵为泄私愤而斥逐异己的行为进行了严厉批评。这道奏疏激怒了王锡爵，也得罪了神宗，结果高攀龙被贬为广东揭阳典史。高攀龙由水路从家乡前往广东就任。在揭阳，高攀龙每天在官衙内教授生徒，培养了不少学生。他还四处察访民情、吏弊，惩治地方恶霸。在揭阳停留的半年内，高攀龙结识了陆粹明及其老师萧自麓，以及明道先生、李材等人，对他的学术思想产生了深远的影响，人生境界也有很大的提高。

万历二十三年（1595）二月，高攀龙回到无锡，居家不仕近三十年。他在漆湖之畔（今蠡湖东岸）建造了一座“水居”，取名“可楼”，作为自己读书静坐的处所。“水居”坐落在湖山环抱之中，环境十分幽雅，他常常在此一住就是一个月。在读书静坐中，他的学术思想日渐成熟，成为当时的儒者宗师。他在学术思想上的贡献，在于提倡“治国平天下”的“有用之学”，反对王学末流的“空虚玄妙”之学。他认为“无用便是落空学问”，“立本正要致用”，把“治国平天下”看做是格物致知和个人道德修养的必然结果。“修身、齐家、治国、平天下”是他毕生追求的政治理想，因此后人评价他“居与游无出乎家国天下”。

高攀龙回到家乡，除了读书静坐外，他的另一个重要活动就是讲学。他与家乡另一位进士出身的学者顾宪成志同道合，交谊颇深。为了有一个讲学的场所，万历三十二年（1604），在常州知府欧阳东凤和无锡知县林宰的支持下，高攀龙与顾宪成等人发起，在北宋学者杨时（龟山）的讲学之所重建了东林书院。重建后的东林书院由顾宪成主持，万历四十年（1612）顾宪成去世后，由高攀龙主持，直到天启五年（1625）书院被拆毁为止。

高攀龙在讲学过程中，除了学术上的传授与交流外，更强调立志做人。他提出做人要真，要老老实实，强调做人要有气节。针对当时士风日下、追名逐利的情况，他指出读书不是为了求取功名富贵，而是为了正心修身。高攀龙等人在讲学的过程中，以自己的政治理想和人格标准来评议朝政，裁量人物，与他们志趣相近的在野士大夫闻风响附，纷至沓来。在朝的李三才、赵南星、邹元标、杨涟等正直官员也与他们互通声气，遥相应和，东林书院实际上已成为社会舆论的中心。他们的反对派对此十分忌恨，诬之为“东林党”，污蔑他们是假借讲学以结党营私。

万历四十八年（1620）七月，神宗去世，皇太子即位，是为光宗。光宗在位仅二十九天便一命呜呼。其后，他的长子朱由校即帝位，是为熹宗。熹宗即位后，东林党人因拥戴有功，重新崛起。天启元年（1621）三月，高攀龙重获起用，被任命为光禄寺丞。九月，到京就任。这时，他已经是一位六十岁的老人了，长期的修身养性，使他早已超脱了名利甚至生死。

天启二年（1622）正月，关外重镇广宁（今辽宁北镇）失陷，明军被迫退缩到山海关一线。消息传来，朝野震惊，人心惶惶。高攀龙接连上书要求革新政治，以挽救濒危的命运。他在《破格用人疏》中提出要破格用人，加强战守之备，并推荐礼部右侍郎孙承宗担任防御大臣，负责处理战事。他的意见得到了皇帝的首肯，而孙承宗也不负众望，收复了广宁和辽河以西的土地，边境平静了四年之久。同时他还上疏追论三案（梃击案、红丸案、移宫案），要求惩治郑养性、李如桢、崔文升等人。他还上了《恭陈圣明务学之要疏》，向明熹宗阐明读书的重要性。由于在疏中涉及到三案，触怒了熹宗，结果反而被罚俸一年。

天启二年九月，高攀龙转任大理寺右少卿，十一月，升任太仆卿，次年晋升为刑部右侍郎，四年升任都察院左都御史。此时，以宦官魏忠贤为首的阉党势力日益扩张，控制了内廷和外廷的行政事务。东林党人向来嫉恶如仇，反对他们利用权势，擅作威福，翦除异己，荼毒内外，纷纷上书参劾。双方的斗争进入了白热化阶段，高攀龙站在了这场政治斗争的风口浪尖。

高攀龙担任左都御史后，就着手清除贪官污吏。他首先命令五城御史在九门张挂《禁绝书仪》。不久，又上《纠劾贪污御史疏》，弹劾御史崔呈秀。疏中揭露崔呈秀在巡按淮扬地区时，贪赃枉法，铺张浪费，要求将崔呈秀从重处分。吏部尚书赵南星经过认真复查，认为事实确凿，提议将崔呈秀遣戍。崔呈秀得知后，连夜投奔魏忠贤，认魏忠贤为义父。高攀龙认为，要治理好天下，地方官是否贤良十分重要，因此拟了一道《具申严宪约疏》，对地方官的职责作了“课农桑”、“兴教化”、“育人才”等共55条具体的规定，府、州、县据此层层考核。他在给登莱巡抚袁可立的书信《答袁节寰中丞》中说道：“下难联者人心，难得者人才，难鼓者士气，得老公祖（袁可立）一点真精神不难矣。”此时，魏忠贤、崔呈秀等人正借会推山西巡抚一事大肆迫害东林党人，结果高攀龙奏疏还未来得及呈上，就被借故罢斥了。高攀龙等人被罢黜后，以魏忠贤为首的阉党全面控制了朝廷内外大权。他们窃国乱政，大兴冤狱，开始对东林党人进行更大规模的迫害，编派了《缙绅便览》、《点将录》、《天鉴录》、《同志录》等黑名单，将不依附于魏忠贤的官员开列在内，统称为东林党人。高攀龙作为东林党的核心人物，自然成为阉党迫害的重点对象。

天启五年（1625）四月，阉党诬蔑东林党人杨涟、左光斗、袁化中、魏大中、周朝瑞、顾大章受贿，将他们送到北镇抚司诏狱，严刑拷打，杨涟等五人死于狱中，顾大章自杀，史称“东林六君子”。八月，魏忠贤下矫旨，将全国的书院全部拆毁，首先就从东林书院拆起。当东林书院被魏忠贤阉党拆毁时，他写下悲愤激昂的诗句：“纵然伐尽林间木，一片平芜也号林。”

天启六年（1626）二月，魏忠贤指使其党羽假造浙江税监李实的奏本，诬告高攀龙、周起元、周顺昌、缪昌期、李应升、周宗建、黄尊素七人贪污袍价十余万两，企图将东林党人一网打尽。高攀龙得知消息后，自知不免，却十分镇静。三月十六日一早，他整冠束带，衣袍整齐，去拜谒了先贤杨龟山祠。回家后与弟高士鹤及两位门生赏花于后花园池畔，谈笑自如。谈兴正浓时，有人叩门而入，告知阉党要抓他的确切消息，顿使高家满门惊惶，惟有高攀龙神情泰然，微笑着对亲人说，“吾视死如归耳”，叮嘱儿孙“无贻祖羞”。还说：“如果贪恋残生，岂不辜负了平生的学问！”当天晚上，全家款叙，高攀龙说笑无异平日。深夜，风声更紧，高攀龙悄悄起床至书斋，写《别友柬》，并提笔向熹宗皇帝奏一疏。书毕，即换上朝服自沉于后花园池中，以示不愿受辱于阉党。高攀龙在《遗疏》中写道：“臣虽削夺，旧系大臣，大臣辱则国辱，故北向叩头，从屈平之遗则。君恩未报，愿结来生。臣高攀龙垂绝书，乞使者执此报皇上。”高攀龙在痛苦无奈之际曾留言同年挚友袁可立道：“弟腐儒一，无以报国，近风波生於讲会，邹冯二老行，弟亦从此去矣（高攀龙《高子文集·答袁节寰中丞》）”，其言犹未尽之厚望可见于笔端。　

高攀龙死后，墓葬今梅园南华利湾。崇祯二年（1629），高攀龙得到平反昭雪，赠太子太保、兵部尚书、谥忠宪。到清朝顺治三年（1646）其墓迁粲山南麓，这就是后人常说的河埒口高攀龙墓，1985年又移建于无锡西郊青山。

四勿强辩，暴以待人，祸患难免。

五无懒惰，取讨不利，账目无有。

六勿轻出，货物轻出，血本必亏。

七勿急趋，货重争趋，需防跌价。

八勿昧时，依时贮发，各有各道。

九勿固执，拘执不通，便成枯木。

十勿贪赊，贪赊多沽，承卖莫结。

十一勿薄蓄，货贱贮积，回复必速。